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胞內染色專題

時間:2017-12-26 14:38:24 瀏覽:

一、研究背景

細胞因子(Cytokines,CKS)是一類多肽及蛋白的總稱,包括白細胞介素和干擾素,集落刺激因子等,參與各種免疫細胞的生長、分化和功能發揮。細胞因子是細胞間普遍存在的信使,起局部或系統調節作用,細胞因子多數是可誘導性的,在各種刺激因素作用下,多種細胞快速合成并分泌細胞因子。正常情況下,細胞因子表達和分泌受機體嚴格的調控,在病理狀態下,細胞因子會出現異常性表達,表現為細胞因子及其受體的缺陷、細胞因子表達過高,以及可溶性細胞因子受體的水平增加等。通過檢測細胞因子的變化,可以發現或指導疾病的治療,例如風濕關節炎的滑膜液中可發現IL-1、IL-6、IL-8水平明顯高于正常人,而這些細胞因子均可促進炎癥過程,使病情加重。應用細胞因子的抑制劑有可能治療這類炎癥性細胞因子水平升高的疾病。研究包括:感染性疾病研究,腫瘤疾病研究,風濕免疫疾病研究,自身免疫性疾病研究等。

二、基本原理

細胞因子檢測是判斷機體免疫功能的一個重要指標,因而具有重要的實驗室研究價值,同時還可能在臨床上有諸多實用價值,包括許多疾病的診斷、病程觀察、療效判斷及細胞因子治療監測等。但是,由于細胞因子在體內的含量甚微,給細胞因子的檢測帶來困維。

目前細胞因子的檢測方法有多種,流式作為免疫檢測的高靈敏度儀器,利用抗原抗體反應的原理,可進行細胞因子的免疫檢測。結合表面染色分群,通過檢測細胞因子的表達情況,可以反映不同細胞的分化狀態和激活狀態。此外,胞內檢測對于研究特殊刺激劑的免疫效果有獨特的優勢。這種方法的優點是特異性強、操作簡便,有良好的發展前景。

本試驗根據合成的細胞因子不同將T細胞分為各種亞群。首先用刺激劑使細胞分泌細胞因子,同時加入莫能霉素或BFA阻斷細胞因子的外排,使細胞因子在胞內聚集,再采用合適的固定劑、透膜劑,從而檢測刺激細胞內部的細胞因子、轉錄因子。

三、研究方

1、主要實驗材料和設備

- 全血細胞或PBMC樣本(懸浮于含鈣的PBS

- 普通低速離心機 (實驗要求為300g~600g,可調轉速可調時間,能離心12x75mm5ml試管),最好為水平轉子

- 12x75mm5ml 流式管

- 固定或可調節的加樣器及相應加樣頭若干:2ul,20ul,100ul,200ul,1ml

- 旋渦混勻器

- 300目過濾尼龍網

- 可放置12x75mm5ml試管的試管架2-3

- PBS溶液和蒸餾水:0.22μm濾膜過濾

- BD FACS流式細胞儀,配置4B-2R-2V

2、實驗前準備

- 儀器質控CST,各通道PASS

- 調節細胞孵箱或水浴至37°C

- 配置buffer,置于4°C保存,配置過程如下圖所示:

3、BD 流式抗體

其他輔助試劑

4、樣本管設置

未刺激樣本管(US)、刺激樣本管(SS

(未刺激樣本管,除細胞不刺激外,其他處理同刺激樣本)

陰性對照管: US未染色管,US染色8色管

單陽管設置: 由于胞內細胞因子的表達水平可能較低,用細胞直接做單染處理,不能獲得足夠的單染陽性細胞群。建議采用BD補償微球(CompBeads)做單染樣本,調節熒光通道之間的補償。

補償微球(CompBeads)的使用:準備9個流式管,每個流式管均加1滴陰性補償微球(NegativeBeads),1滴陽性補償微球(CompBeads),除第一管外,其余每管分別加入一種熒光相應的抗體(1 Test體積或0.5μg)。

5、樣本制備流程圖(分別為全血、PBMC、培養細胞)

表面染色、固定及破膜:

刺激后直接進行表面染色,后續過程如下圖:

5.1 外周全血樣本處理過程

- 取血:肝素鈉真空抗凝采血管取人外周血全血1-2ml,血液室溫放置,8 小時內進行檢測,否則棄用。

- 刺激細胞活化:每個樣本管分別加入200μL抗凝全血(裂解紅細胞后,白細胞濃度達到2×10^6細胞/mL),

- 每樣本管加入4μl BD Leukocyte Activation Cocktail with BD GolgiPlug (刺激劑和蛋白轉運抑制劑),混勻。37°C,5% CO2培養箱或37°C水浴孵育4-6小時。

- 細胞表面標記染色:向樣本管加入相應體積的CD3, CD4, CD8, CD25抗體(依據樣本不同,需要滴定抗體濃度),室溫避光孵育15-30分鐘。

- 制備1X紅細胞裂解液:取10X紅細胞裂解液,按照體積1(10X紅細胞裂解液)9(dH2O),稀釋。

- 裂解紅細胞:每100ul全血加入2ml 1X紅細胞裂解液,室溫裂解8-12min,至細胞懸液呈澄清透明狀。

- 裂紅后,500g,離心5分鐘,洗滌細胞,離心后棄上清。加入1ml Staining Buffer,500g,離心5分鐘,洗滌細胞,離心后棄上清。

- 緩沖液制備 (BD Transcription Factor Buffer Set),現用現配

1體積 TF Fix/Perm Buffer (4X),3體積TF Diluent Buffer,1:3混合,配制成1X TF Fix/Perm Working Solution;

1體積 TF Perm/Wash Buffer(5X),4體積 dH2O,1:4混合,配制1X Perm/Wash Working Solution。

- 細胞固定、破膜:重懸細胞,每管加入1 ml新鮮配制的1X TF Fix/Perm Working Solution,渦旋混勻,2-8°C避光孵育40-50分鐘。

- 每管直接加入1 ml 1X Perm/Wash Working Solution到固定的細胞中,2-8°C 500g 離心5分鐘,棄上清。每管加入2 ml 1X Perm/Wash Working Solution,2-8°C 500g離心5分鐘,棄上清。

- 胞內染色:每管加入80-100ul 1X Perm/Wash Working Solution,同時加入相應的IL-4,IFN-g,IL-17A,FoxP3,渦旋混勻,2-8°C 避光孵育40-50分鐘。

- 渦旋細胞,每管加入2 ml 1X Perm/Wash Working Solution,2-8°C 500g離心5分鐘,棄上清。

- 重復第11步驟一次,每管加入500ul PBS洗液,上機檢測即可。

5.2 PBMC樣本處理過程

- 肝素鈉真空抗凝采血管取人外周血全血,用Ficoll (GE公司)淋巴細胞分離液分離PBMC。

- PBMC制備請參考Ficoll產品使用說明書。

- 將分離后的PBMCPBS(含鈣離子)洗滌,500g,5min,離心棄上清

如果樣本當天不檢測,可以在液氮條件下凍存:10%DMSO+90%胎牛血清

如果當天檢測,用PBS重懸細胞,調整濃度至1-2x10^7細胞/ml。

- 將200μl 細胞懸液(2x10^6細胞)轉移至12 x 75 mm 圓底流式管中。

- 刺激細胞活化:向每個樣本管加入4μl BD Leukocyte Activation Cocktail with BD GolgiPlug (刺激劑和蛋白轉運抑制劑),混勻。37°C,5%CO2培養箱或37°C水浴孵育4-6小時(不超過6個小時)。

- 細胞表面標記染色:向樣本管加入相應體積的CD3, CD4, CD8, CD25抗體(依據樣本不同,需要滴定抗體濃度),室溫避光孵育15-30分鐘。

- 加入1ml Staining Buffer,500g,離心5分鐘,洗滌細胞,離心后棄上清。

- 緩沖液制備 (BD Transcription Factor Buffer Set4),現用現配

1體積 TF Fix/Perm Buffer (4X),3體積TF Diluent Buffer,1:3混合,配制成1X TF Fix/Perm Working Solution

1體積 TF Perm/Wash Buffer(5X),4體積dH2O,1:4混合,配制1X Perm/Wash Working Solution

- 細胞固定、破膜:重懸細胞,每管加入1 ml新鮮配制的1X TF Fix/Perm Working Solution,渦旋混勻,2-8°C光孵育40-50分鐘。

- 每管直接加入1 ml 1X Perm/Wash Working Solution到固定的細胞中,2-8°C 500g 離心5分鐘,棄上清。

- 每管加入2 ml 1X Perm/Wash Working Solution,2-8°C 500g離心5分鐘,棄上清。

- 胞內染色:每管加入80-100ul 1X Perm/Wash Working Solution,同時加入相應的IL-4, IFN-g,IL-17A,FoxP3后,渦旋混勻,2-8°C 避光孵育40-50分鐘。

- 渦旋細胞,每管加入2 ml 1X Perm/Wash Working Solution,2-8°C 500g離心5分鐘,棄上清。

- 重復第13步驟一次,每管加入500ul PBS洗液,上機檢測即可。

6 、上機檢測(以Diva軟件為例):

- 儀器質控:使用CST微球按照操作手冊進行儀器質控。

- 在Diva軟件中依次創建New Folder> Experiment > Speciman > Tube。

- 在Parameters窗口中保留:APC-Cy7、PE-Cy7、PerCP-Cy5.5、BV510、PE、FITC、BV421、AF647。

- 上US未染色管,調節各通道電壓,使樣本熒光強度高于各熒光通道的最低檢測范圍(不記錄)。

- 在菜單欄中選擇Experiment> Compersation Setup> Create Compersation Controls,點擊OK。自動生成名稱為Compensation ControlSpeciman,包含陰性對照管(NegativeBeads)及各單陽補償管(CompBeads);

Normal Worksheet中自動生成陰性對照管及各單陽補償管的獲取模板。

- 上Negative TubeCompBeads),調節FSC/SSC電壓,使P1門圈中樣本群,單擊右鍵,將P1門應用到所有補償對照管(不記錄);將各單陽管依次上樣,調整電壓,確認陽性群低于各熒光通道的最高檢測范圍

- Compensation Tubes順序上樣,依次記錄各CompBead管,調整P1P2位置,在菜單欄中選擇Experiment > Compersation Setup> Calculate Compersation,重新命名補償名稱,并鏈接應用補償。

- 依次記錄實驗的US未染色管、US染色8色管、刺激樣本管。

7、實驗結果

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