您好,歡迎光臨壯志生物網站!
關注我們
服務熱線:029-82520312

全部產品分類

您當前位置:首頁 >> 資料中心 >>  技術專欄

WB 實驗方案大全

時間:2017-12-15 09:34:51 瀏覽:

白質印跡

免疫印跡是利用聚丙烯酰胺凝膠電泳來檢測特定樣品或提取物中某種特定蛋白的方法。聚丙烯酰胺凝膠緊貼著膜放置,常用的膜是硝酸纖維素或PVDF(聚偏乙烯氟化物),在電流的作用下蛋白質從凝膠遷移到膜上并且被固定。膜是凝膠蛋白質的復制品,然后可以與抗體結合后進行染色。

                       Oncotarget,2017,14;8(7):11600-11613.

下面的免疫印跡模式圖包括樣品準備、凝膠電泳、凝膠到膜的轉移以及檢測蛋白的免疫染色。根據使用的電泳和轉移設備,實驗方案需要優化,建議讀者參照廠家的說明書。





一、樣品準備

1、裂解緩沖液

準備凝膠電泳的樣品,需要對細胞和組織進行裂解以釋放目的蛋白,這些可溶性蛋白能夠穿過分離膠單獨移動。裂解緩沖液有很多種,但用 來做 WB試驗的僅有少數幾種。簡單來說,它們溶解蛋白的能力不同,含有十二烷基硫酸鈉和其他離子型去污劑的溶解能力最強。

大部分 Abcam 抗體能夠識別降解和變性蛋白質,因此應該在降解和變性條件下使用該類抗體。需要注意的是一些抗體僅僅識別天然的、非變 性蛋白質,故不能識別經去污劑(SDS、脫氧膽酸鹽、弱降解作用的 Triton X-100 NP40)作用的蛋白質。

選擇裂解緩沖液首先要考慮選擇的抗體是否識別變性的樣品。如果不能,有關資料會列在抗體說明書上,應該使用不含去污劑的緩沖液或者 是相對溫和的非離子型緩沖液(NP-40,吐溫 X-100)。

蛋白定位和裂解液的選擇


樣品類型

裂解液

全細胞

NP-40RIPA

細胞質(可溶性的)

Tris-HCI

細胞質(細胞骨架)

Tris-Triton

膜結合部分

NP-40RIPA

細胞核

RIPA或核裂解液

線粒體

RIPA或線粒體分離方案

*專門或主要表達在亞細胞結構區域的蛋白在亞細胞裂解物中比在全細胞和組織裂解物中更為富集。這對于提取弱表達蛋白非常重要。例如, 相對于全細胞或全組織裂解物來說,核表達蛋白在細胞核裂解物總蛋白中占有相當大的比例,這樣凝膠條帶中可以載入更多的目的蛋白。 另一個優點是排除了雜質成分潛在的交叉反應。請參考我們的亞細胞結構分離技術方案。

Nonidet – P40(NP40)緩沖液

這是研究細胞質蛋白、膜結合蛋白或者全細胞抽提物等常用的一種緩沖液。如果目標蛋白不能完全從不溶性或凝集物中提取, RIPA 緩沖液將 會更合適,它包含的離子型去污劑能更好溶解蛋白。

RIPA緩沖液(放射免疫沉淀分析緩沖液)


這種緩沖液對全細胞提取物和膜結合蛋白都非常有用,對提取細胞核蛋白來說,這種緩沖液比只含有 NP40 Triton X-100 的緩沖液更受歡 迎。但它會破壞蛋白與蛋白之間的相互作用,因此這在免疫沉淀測定中會有些問題。

在需要保存蛋白與蛋白相互作用,或者將蛋白變性降到最低(例如,抗體只能識別一個非變性表位)時,應該使用不含離子型去污劑(SDS)的緩沖液和不含非離子型去污劑(Triton X-100)的緩沖液。用不含去污劑的裂解液,一般需配合機械剪切來裂解細胞,常用的 Dounce 均漿器 或者將細胞反復通過注射器針頭。這時簡單的Tris緩沖液就足夠了,但是對于膜結合蛋白或細胞骨架蛋白則需要含有去污劑的緩沖液。


2、蛋白酶和磷酸酶抑制劑

一旦裂解發生,水解、去磷酸化和變性就開始了。如果樣本在冰上或始終在 4°C 存放以及一開始就往裂解液中加入適當抑制劑的話,這些反應將可以大大減緩。

混合(雞尾酒)的蛋白酶和磷酸酶抑制劑已經商品化,也可以自己研制抑制劑的配比。

抑制劑

蛋白酶或磷酸酶

在裂解液中的終濃度

貯備液(保存在 -20°C)

抑酶肽

胰島素、胰凝乳蛋白酶、

2μg/ml

水稀釋至 10mg/ml

血纖維蛋白溶酶

一旦融化不能再使用

亮肽酶素

溶酶體

5-10μg/ml

水稀釋,一旦融化不能再使用

抑肽素A

天冬氨酸蛋白酶

1μg/ml

甲醇稀釋,1mM

苯甲基磺酰氟化物(PMSF)

絲氨酸半胱氨酸蛋白酶

1mM

乙醇稀釋,可重復使用

乙二胺四乙酸(EDTA

需要 Mg++ Mn++

5mM

水稀釋至 0.5M 調節 pH8.0

金屬蛋白酶

乙二醇雙(2-氨基乙醚)

需要 Ca++ 的金屬蛋白酶

1mM

水稀釋 0.5M 調節 pH 8.0

四乙酸(EGTA

氟化鈉

絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶

5-10mM

水稀釋,一旦融化不能再使用

原釩酸鈉

酪氨酸磷酸酶

1mM

水稀釋,一旦融化不能再使用

3、原釩酸鹽準備

-所有步驟均在通風櫥中進行。

-用雙蒸水溶解原釩酸鈉至 100mM。

-用鹽酸調 pH 值至 9.0。

-加熱至無色。為盡量減少由于蒸發所致體積減小,加熱時加蓋。

冷卻至室溫。

-調 pH 值至 9.0。

-再次加熱至無色。

-再次加熱冷卻重復以上循環直至加熱冷卻后溶液 pH 值保持在 9.0。

-用水補至起始體積。

--20°C 分裝保存,若變黃則廢棄。

4、細胞培養裂解物的制備

-將細胞培養皿放置冰上并用冰冷的 PBS 洗滌細胞。

-吸干 PBS 后,再加入冰冷的裂解液(每 107 細胞 / 100mm2 培養皿/150cm2 培養瓶加 1ml,每5x106 細胞 / 60mm2 培養皿 / 75cm2 培養瓶 0.5ml)。

-用預冷的塑料細胞刮刀將貼壁細胞從培養皿上刮下,然后輕輕將細胞懸液轉移到預冷的小離心管中。

-4°C 持續振蕩 30 分鐘。

-4°C 預冷微型離心機中 16,000 x g 離心 20 分鐘。

-從離心機中輕輕地取出離心管放置在冰上。將上清液吸出轉移到預冷的新管(放在冰上)中,棄沉淀。

5、組織裂解物的制備

-用干凈器械解剖所需的組織,最好在冰上,并快速操作以防止蛋白酶降解。

-將組織放入圓底離心管或 Eppendorf 管中,浸入液氮中速凍。樣本在 -80°C 儲存備以后使用或放在冰上立即勻漿。

-對于約 5mg 組織,向管中迅速加入約 300μl 裂解液并用電動勻漿器均漿,裂解液沖洗刀片兩次,每次 300μl,然后 4°C 持續振 2 小時(將 回旋振蕩器放入冰箱)。裂解液的體積根據組織總量來決定。蛋白提取物不宜過于稀釋,以避免蛋白質損失,并盡量減少樣品體積以便凝 膠上樣。最小濃度為 0.1mg/ml;最佳濃度為 1-5mg/ml。

-微型離心機 4 16,000rpm 離心 20 分鐘。從離心機中輕輕地取出離心管放置在冰上。吸出上清液放入預冷的新管(放在冰上)中,棄沉淀。

6、蛋白質濃度的測定

Bradford、Lowry BCA 方法測定蛋白質含量,牛血清白蛋白是常用的蛋白標準。

一旦確定了每管的蛋白濃度就可以在 -20°C -80°C 冷凍樣品備用,或為免疫沉淀反應或凝膠上樣做準備。

7、凝膠上樣:變性的和天然的,還原的和非還原

變性還原蛋白

抗體特異性識別目標蛋白的部位(即抗原表位)可能存在于蛋白的三維構型內部。為了能使抗體接近抗原表位,必須將蛋白的三維構型打開, 即使蛋白變性。

要使蛋白質變性,使用含陰離子變性去污劑十二烷基硫酸鈉 (SDS) 的上樣緩沖液,95-100°C 煮沸 5 分鐘,或者在 70°C 加熱 5-10 分鐘,尤 其是研究跨膜蛋白時,因為煮沸更易聚集,聚集物不能有效的進入膠中。

標準品上樣緩沖液叫做2Laemmli緩沖液,最初描述在《自然》雜志上(1970 Aug 15;227(5259):680-5.)。也可以用4倍和6倍的樣品緩沖 液,可以減少緩沖液對樣品的稀釋。2 倍的樣品緩沖液和樣品以 1:1 的比例混合。

使用 SDS,通過 SDS 陰離子的粘附作用,所有的蛋白質都帶負電荷,SDS 通過纏繞多肽鏈使蛋白變性。SDS 1.4:1 的比例結合到蛋白 上,SDS 賦予多肽的負電荷數與蛋白的長度成比例,即變性的多肽成為負電荷云的,每一單位長度的多肽帶有相同的電荷數或電荷云密度。

在變性 SDS-PAGE 中,遷移率不是由多肽固有的電荷數目來決定,而是由多肽的分子量來決定。SDS 的純度尤為重要,蛋白質被染色的背 景與蛋白條帶能顯示出 SDS 質量的好壞。

通過加入β巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT),按照分子量大小進行分離,在蛋白形成自由彎曲之前減少二硫鍵的形成是非常必要的。

上樣緩沖液中加入甘油能增加樣品的密度,使樣品停留在樣品池的底部,防止外溢和使凝膠上樣不規則。

為了能看到蛋白的遷移,通常在上樣緩沖液中加入小分子的離子型染料(如溴酚藍)。染料在混合物中的遷移速度最快,能夠提供一個遷移 前沿來監測分離的過程。

蛋白質樣品處理時,加熱前后都要用漩渦振蕩器徹底混勻樣品,使溶解徹底。

天然的未降解樣品

有些抗體識別的抗原表位在抗原的天然構型中由非臨近氨基酸組成。雖然這些氨基酸在原始序列中是彼此分開的,但它們在蛋白的三維結構 中是相互靠近的??固逯荒鼙嬡顯謖鄣峁貢礱嬪系目乖?。

在這樣的情況下進行非變性條件 WB 是不可避免的,這一點會在產品的數據表上的應用部分提到。總之,非變性條件就意味著樣品和電泳緩 沖液中不加入 SDS,以及不加熱樣品。

有些抗體僅僅識別非還原形式的蛋白質,如氧化形式(特別是半胱氨酸殘基)的蛋白質。引起降解的試劑β巰基乙醇和 DTT 必須從上樣緩沖 液和電泳緩沖液中除去。

蛋白狀態

凝膠條件

上樣緩沖液

電泳緩沖液

還原-變性

還原 & 不變性

β-巰基乙醇或DTTSDS

SDS

還原-天然

還原 & 不變性

β-巰基乙醇或DTTSDS

SDS

氧化-變性

非還原 & 變性

β-巰基乙醇或DTT,有SDS

SDS

氧化-天然

非還原 & 天然

β-巰基乙醇或DTT,無 SDS

SDS

二、電泳

電泳可以是單相的(即一維分離)也可以是雙相的。單相電泳常用來進行蛋白和核酸的分離,蛋白的雙相電泳用于指紋-識別(即總蛋白成分分析)和細胞里所有蛋白的精確定位。

這里我們所描述的是單相電泳技術。我們推薦《Gel Electrophoresis of Proteins: A Practical Approach》(第三版,B. D. Hames D. Rickwood 主編,實用方法系列,牛津大學出版社,1998年)這本書作為理解雙相電泳的參考。

1、PAGE 凝膠的制備

聚丙烯酰胺凝膠電泳,英文簡稱是 SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis),是根據蛋白質分子量來分離 蛋白質的基本方法。

聚丙烯酰胺凝膠由兩種復合物混合而成,丙烯酰胺和 N,N-亞甲基丙烯酰胺(簡稱bis)。Bis 是凝膠的交聯劑。通過加入過硫酸銨和 DMAP TEMED 啟動交聯聚合作用。凝膠是中性,水溶性三維網狀結構(通過亞甲基交聯的碳氫化合物)。

凝膠對分子的分離取決于凝膠所形成的孔徑大小。凝膠孔徑的大小由兩個因素決定:丙烯酰胺的總量(%T)和交聯的數量(%C),當丙烯 酰胺的比例升高,孔徑降低。5% C 時孔徑最小。C% 增加或減少,孔徑也隨之增大或減少。凝膠以百分比進行設計,并且有二個重要的參 數。總丙烯酰胺指的是丙烯酰胺加上bis丙烯酰胺所占的百分比(w/v)。例如,7.5% T 表示 100ml 凝膠中有 7.5 g 丙烯酰胺和 bis。

凝膠可以商業購買或在實驗室自己制備(配方可以在實驗室手冊上找到)。膠凝體的百分比對蛋白質遷移率和分離度至關重要。

拇指原則:目標蛋白分子量越小,mono/bis百分比越高;目標蛋白分子量越大,mono/bis的百分比越低。

蛋白大?。?/span>kDa

凝膠百分比(%

4-40

20

12-45

15

10-70

12.5

15-100

10

25-200

8


按照廠家說明將凝膠放在電泳槽中并且浸泡在電泳緩沖液中。

陽性對照

陽性對照裂解物用來表明試驗是有效的并且是正確的,及可證明目標蛋白不在樣本中表達。

當設定一個新實驗時,我們強烈推薦使用陽性對照裂解物,這將提高試驗的可信度。

分子量標準

跑在樣品旁邊的分子量標準能測定蛋白分子量的大小并且能監測電泳的進展。市面上有許多分子量標準可供選擇。

Abcam有下列分子量標準:

貨號 ab48854 (MW 70, 57, 40, 28, 18, 13.5 and 8.5 kDa)

貨號 ab115832, Prism Protein Ladder (10-175 kDa)

貨號 ab116027, Prism Ultra Protein Ladder (10-180 kDa)

貨號 ab116028, Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa)

貨號 ab116029, Prism Ultra Protein Ladder (3.5-245 kDa)

2、上樣和跑凝膠

使用特定的凝膠上樣吸頭或微型注射器在狹窄的樣品池中加入全部樣品,注意不要用尖頭刺破池的底部,否則會形成扭曲的條帶。

不要過度填充樣品池,如果樣品溢入旁邊的樣品池,將會影響結果。 每個樣品池裝載 20-40μg 蛋白。

將凝膠浸泡在電泳緩沖液中,這些緩沖液通常包含 SDS,天然的凝膠電泳除外。

一個標準的 PAGE 電泳緩沖液,又叫運行(running)緩沖液,是氨基乙酸-甘氨酸

跑凝膠時按照廠家推薦的時間進行,這些可以隨著儀器的改變而變更(根據電壓,1 小時至過夜)。

當染料分子(遷移前沿)到達凝膠的底部,關閉電源。此時蛋白會從凝膠上慢慢的洗脫,因此不要保存在凝膠里,要迅速進行下一步的 轉移操作。

內參的使用

內參是用來檢測凝膠中的泳道是否載有相同的上樣量。在比較不同樣品的蛋白表達水平時這一點尤其重要。這對檢查整個凝膠的平均轉膜亦 十分重要。如有上樣或轉膜不平均的情況,內參對照可用來定量每條泳道的蛋白量。對于準備發表出版的試驗,加入對照是絕對必需的。

內參

樣品類型

分子量(kDa

注意事項

β肌動蛋白

全細胞/細胞質

43

不適用于骨骼肌樣品,細胞生長條件的改變和細胞外基質成分

的相互作用可 能會改變肌動蛋白的合成(Farmer et al, 1983

GAPDH

全細胞/細胞質

30-40

一些生理因素例如缺氧癥和糖尿病會增強 GAPDH 在特定細胞

中的表達

微管蛋白

全細胞/細胞質

55

微管蛋白的表達隨著抗菌和抗有絲分裂抗性藥物而改變

(Sangrajrang S. et al, 1998, Prasad V et al, 2000)。

VDCA1/膜孔蛋白

線粒體

31

-

COXIV

線粒體

16

許多蛋白像 COXIV 出現在 16kDa 的位置

核纖層蛋白 B1

細胞核

66

不適合核膜被除去的樣本

TATA 結合蛋白TBP

細胞核

38

不適合 DNA 被除去的樣本

三、蛋白轉膜和染色

1、凝膠內蛋白的顯色

蛋白顯色的階段非常重要,可以知道蛋白遷移的是否均勻、平坦。如果分離后的蛋白需要轉膜,就用銅染,因為考馬斯藍染色是不可逆的。 考馬斯藍染色只用來檢測轉移的有效性,或者蛋白不需要轉膜時,只用于觀測蛋白 SDS-PAGE 分離的結果。

考馬斯亮藍染色


電源關閉,分離的蛋白帶就會擴散,因為蛋白在溶液中是可溶的,為了防止擴散,凝膠中加入 40% 雙蒸水、10% 醋酸、50% 甲醇,能使蛋 白質沉淀(變成不溶性的)。在上述溶液中加入 0.25% 考馬斯亮藍 R-250 使被固定的蛋白染色,在搖床上保持搖動,室溫,4 小時至過夜。 轉移凝膠至 67.5% 雙蒸水、7.5% 醋酸、25% 甲醇混合物中(染料混合物保存起來,可多次重復使用)潤洗,一直在搖床上震搖,中間更換 潤洗液,直到洗去多余染料。染料不會結合到丙烯酰胺上,凝膠背景清晰,凝膠中的蛋白條帶染成深藍色。

銅染法

電泳凝膠用蒸餾水清洗數秒鐘(最多 30 秒),然后轉移至 0.3 M CuCl2 溶液中染色 5-15 分鐘,再用去離子水洗一次,在暗背景下觀察,在 藍色膠背景下蛋白出現透明條帶。

將膠置于 0.1- 0.25 M Tris/0.25 M EDTA pH 8.0 緩沖液中漂洗凝膠完全脫色,根據廠家說明再置于電轉緩沖液中開始轉膜。

2、蛋白轉膜

- 詳細的轉膜操作可以在電轉儀廠家的網頁上找到,不同的系統操作也有區別。蛋白從凝膠至膜的轉移應用的原理是電荷在電場中的遷移。

- 轉膜方式分為半干轉移和濕轉移兩種,半干式轉膜速度快,而濕式轉膜不會因為膜的干燥而失敗,因此成功率高并特別適合用于分子量大 100kDa 的蛋白。兩種轉膜方式都是膜緊貼凝膠,位于兩層吸收材料之間,固體夾板夾在外面以保證膜和凝膠的緊密接觸。

- 濕式轉膜中膜和凝膠的三明治結構位于濾紙和海綿體之間(海綿/////海綿),全部緊密排列,特別是膠/膜之間不能留有氣泡。整 個三明治結構浸泡在轉移緩沖液中,然后施加電場。帶負電荷的蛋白向陽極移動。但膜阻擋了它們,并與其進行結合,從而阻止了它們的 繼續移動。凝膠一般在 100V 條件下運行 1~2 小時,時間和電壓可以優化,我們推薦根據廠家的說明進行操作。


- 標準的濕轉緩沖液和電泳緩沖液一樣,為不含 SDS 1X Tris-gly 緩沖液,加入甲醇至終濃度 20%。如果轉膜的蛋白分子量大 80kDa, 則推薦加入 SDS 使之終濃度為 0.1%。

- 半干式轉膜中,三明治結構紙/凝膠//紙用轉移緩沖液浸濕,直接置于電轉儀的正負極之間。在進行轉移時,要注意一定要使膜緊貼陽極 而膠緊貼陰極。所用的電轉緩沖液中 Tris 和甘氨酸的比例不一定和濕轉的相同,需參考廠家的儀器說明書。標準配方是:48mM Tris、 39mM 甘氨酸、0.04% SDS、20% 甲醇。

- 兩類膜可供選擇:硝酸纖維素膜和 PVDF 膜(正電荷尼龍膜)。PVDF 膜需要小心地進行前處理:剪出大小合適的膜,在甲醇中浸泡 1-2 鐘,再孵育于冰冷的電轉緩沖液中5分鐘。膠也需在冰冷的電轉緩沖液中平衡 3-5 分鐘,否則轉膜時會起皺導致條帶變形。

大蛋白和小蛋白轉膜時的注意事項

電轉移緩沖液中 SDS 與甲醇的平衡、蛋白大小、膠濃度都會影響轉膜效果,如下調整可以增加轉膜效果。

大蛋白(大于100 kDa)

- 對于大蛋白而言,其在凝膠電泳分離遷移較慢,而從凝膠轉出也非常慢,因此對于這種大分子量蛋白應該用低濃度的凝膠,8%或更低, 但因低濃度的膠非常易碎,所以操作時需十分小心。

- 大蛋白易在凝膠里形成沉淀,從而影響轉膜。轉膜時在電轉移緩沖液加入 SDS 至終濃度 0.1%,避免出現這種情況。甲醇易使 SDS 從蛋 白上脫失,因此相應降低甲醇的濃度至 10% 或更低,以防止蛋白沉淀。

- 降低電轉移緩沖液中甲醇的比例,這樣可以促進凝膠的膨脹,更易于大蛋白的轉出。

- 只有使用硝酸纖維素膜時,甲醇才是必需的。如果是 PVDF 膜,甲醇可以不必加入電轉移緩沖液中,但轉膜前 PVDF 需用甲醇活化。

- 選擇濕式,4 轉膜過夜,以取代半干式轉膜。

蛋白(小于100 kDa)

- SDS 阻止蛋白與膜的結合,小蛋白更是如此。因此,對于小分子的蛋白,電轉移緩沖液中可以不加 SDS。

- 保持 20% 的甲醇濃度

避免手指直接接觸膜,應使用鑷子,手指上的油脂與蛋白會封閉轉膜效率并易產生背景污斑。 在濾紙間排列凝膠和膜時,盡量用移液器或 15ml 試管趕除膠與膜之間的氣泡,或在轉移緩沖液中進行以防止氣泡產生,請戴手套!確認裁剪的膜和濾紙與凝膠尺寸相同,邊緣太大會導致在進行半干式轉膜時電流不能通過膜。雞抗體易與 PVDF 膜和其它尼龍膜結合,導致高背景,請替換成硝酸纖維素膜以降低背景。

3、膜上蛋白的顯像:麗春紅

為檢測轉膜是否成功,用 TBST 洗膜(TBST 溶液的配制詳見 71 頁緩沖液章節)。準備貯備液:2% 麗春紅 S 溶于 30% 三氯乙酸和 30% 基水楊酸,室溫下震搖 5 分鐘。1:10 稀釋貯備液。

然后將膜浸泡在水中直至水變清且蛋白條帶清晰。

TBST 或水重復洗膜直至膜完全脫色,PVDF 膜需用甲醇活化后再用 TBST 洗。

4、膜的封閉

有兩種傳統封閉液:脫脂奶粉或 BSACohn 因子 V),脫脂奶粉成本低但不能用于磷酸化蛋白(因脫脂奶粉含有酪蛋白,該蛋白本身就是 一種磷酸化蛋白,會結合磷酸化特異性抗體而易產生高背景。)

為防止一抗或/和二抗與膜的非特異性結合,需要進行膜的封閉。

某些抗體用 BSA 封閉時可能會產生比脫脂奶粉更強的信號,請仔細閱讀說明書,以確定有無特殊封閉膜方法。

用封閉緩沖液封閉 1 小時,4°C 震搖,封閉后用 TBST 5 秒。

5、一抗的孵育

孵育緩沖液

按抗體說明書建議的稀釋倍數,用 TBST 稀釋一抗。如果說明書沒有建議稀釋倍數,則參照一般推薦的稀釋倍數 (1:100-1:3000) 進行預試驗,根 據試驗結果選擇合適稀釋倍數,一抗濃度過高會導致產生非特異性條帶。孵育緩沖液

某些實驗室傳統上在封閉液中孵育抗體,而有些實驗室用不含封閉劑的 TBST 來孵育抗體,結果因抗體而異,有時兩者結果相同,有時結果 不同。

孵育時間

一抗的孵育時間可從幾小時至過夜(一般不超過 18 小時)不等,具體取決于抗體與蛋白的親和性和蛋白的豐度,建議使用較高的抗體稀釋 倍數和較長的孵育時間來保證特異性結合。

孵育溫度

如果在封閉液中孵育過夜,應在 4oC 進行,否則污染會導致蛋白降解(特別是磷酸基團)。孵育一抗時需保持適當的搖動使之均勻覆蓋膜,防 止結合不均勻。

6、二抗的孵育

一抗孵育結束后,用 TBST 搖動洗膜數次,每次 5 分鐘或更長,去除殘留的一抗。

孵育緩沖液和稀釋:

按說明書推薦的倍數用 TBST 稀釋二抗,如果說明書沒有標出稀釋倍數,則按常規的倍數稀釋 (1:1000- 1:20,000) 預實驗,二抗的濃度過高 也會導致非特異性條帶。

可以在封閉液中孵育二抗(和一抗),但可能在降低背景同時導致特異性條帶的信號也減弱,可能是封閉劑阻礙了抗體與靶蛋白的結合。

孵育時間和溫度:

室溫振蕩 1-2 小時。

標記物:推薦使用 HRP 標記二抗,不建議使用 AP(堿性磷酸酶)標記二抗,因其不夠靈敏。

7、顯色方法

檢測試劑盒:

HRP 標記二抗:傳統上使用 ECL ECL+(自制或購買),推薦使用后者。對于新一代檢測儀器例如 Genegnome,請用儀器制造商推薦的試劑盒。

我們不推薦 ECL BCIP/NBT 試劑盒,因為不夠靈敏。

X-ray 膠片:

傳統上使用手工曝光的方法,可控制 X-ray 膠片在曝光劑和定影劑的時間。而全自動 X-ray 膠片曝光器也已經廣泛使用且操作簡便。

五、蛋白印跡疑難解答提示

1、無信號

- 一抗和二抗不匹配

二抗需和一抗宿主的物種相同(如一抗來自兔,二抗為抗兔抗體)。

- 沒有足夠的一抗或二抗結合目標蛋白

使用高濃度抗體,延長 4 孵育時間(如過夜)。

- 封閉劑與一抗或二抗有交叉反應

使用溫和的去污劑如吐溫-20,或更換封閉劑(常用的脫脂奶粉、BSA、血清或明膠)。

- 一抗不識別檢測物種的蛋白

參照說明書,比對免疫原序列和蛋白序列以確??固搴湍康牡鞍諄岱⑸從?,設置陽性對照。

- 抗原量不足

每泳道蛋白上樣量不低于 20-30 μg,使用蛋白酶抑制劑并設置陽性對照。

- 組織中目的蛋白含量低

濃縮使信號最大化(例如檢測核蛋白要用核裂解物)。

- 轉膜不充分

使用可逆染色劑例如麗春紅 S 檢測轉膜效果,檢查轉膜操作是否正確。PVDF 膜需預先浸在甲醇中,然后浸到轉移緩沖液中。

- 洗膜過度

勿過度洗膜。

- 過度封閉使目標蛋白不能顯色

代替 5% 脫脂奶粉,使用含 0.5% 脫脂奶粉或無脫脂奶粉的抗體稀釋液,或更換封閉劑,減少封閉時間。

- 一抗失效

使用新鮮抗體,重復使用有效濃度會降低。

- 二抗受疊氮鈉抑制

避免疊氮鈉和 HRP 標記抗體一起使用。

- 檢測試劑盒過期和底物失活

使用新鮮的底物。

2、背景高

- 未進行非特異性封閉或封閉不充分

延長封閉時間,考慮更換合適的封閉劑。Abcam 推薦 5% 脫脂奶粉、3% BSA 或血清封閉 30 分鐘。這些可以包含在抗體緩沖液中。

- 一抗濃度過高

稀釋抗體至合適濃度,以更高稀釋度抗體孵育更長時間(耗時長但特異性結合最好)。

- 抗體孵育溫度過高

4°C 孵育。

- 二抗與封閉劑非特異性結合或反應

設置二抗對照(不加一抗)。

- 一抗或二抗與封閉劑有交叉反應

在孵育和洗滌液中加入溫和去污劑如吐溫 -20。脫脂奶粉含有酪蛋白,該蛋白本身就是一種磷酸化蛋白,會結合磷酸化特異性抗體而易產生 高背景。使用 BSA 代替奶粉作為封閉劑。

- 未結合蛋白質洗滌不充分

增加洗滌次數。

- 膜的選擇導致的高背景

NC 膜比 PVDF 膜背景低。

- 膜干燥

在孵育過程中防止膜變干,在任何步驟都保證膜有充分的反應液,放入攪拌子不斷攪動或輕輕振蕩使膜浸在溶液中,避免出現干膜現象。

3、多帶現象

- 細胞傳代次數過多,使其蛋白表達不同

使用原始未傳代的細胞株,和現在的細胞株一起做平行對照實驗。

- 體內表達的蛋白樣本具有多種修飾形式如乙?;?、甲基化、烷基化、磷酸化、糖基化等查閱文獻,使用試劑使樣品去磷酸化、去糖基化來驗證翻譯后的修飾。

- 蛋白樣本降解(蛋白質分子量降低)

在樣品緩沖液中加入足夠的蛋白酶抑制劑。

- 檢測到未經報道過的新蛋白或同一蛋白家族中具有相似表位而結構不同的蛋白

查閱其它文獻報道,或 BLAST 搜尋,使用說明書推薦的細胞株或組織。

- 一抗濃度過高,高濃度時常出現多條蛋白帶

降低抗體濃度和/或孵育時間。

- 二抗濃度過高,高濃度產生非特異性結合

降低抗體濃度,增加二抗對照(不加一抗)。

- 抗體未經純化

使用親和純化的抗體,減少非特異條帶。

- 條帶為非特異性條帶

應用封閉多肽來區分特異性和非特異性條帶,只有特異性條帶能被封閉從而消失。

- 靶蛋白形成多聚體

SDS-PAGE 電泳上樣前,煮沸 10 分鐘而不是 5 分鐘,使蛋白質解聚。

3、背景有不均勻的白色斑點

- 轉膜時膜上有氣泡或抗體在膜上分布不均

轉膜過程中盡量去除氣泡,抗體孵育時保持搖動。

4、背景有黑色斑點

- 抗體結合了封閉劑

過濾封閉劑。

5、深背景出現白色條帶(非預期背景)

- 一抗或二抗加入過多

稀釋抗體的濃度。

6、分子量蛋白標準條帶呈黑色

- 抗體和分子量蛋白標準發生了反應

在分子量蛋白標準和第一個樣品之間增加一個空白條帶。

7、目的條帶染色過低/過高

- 分離不徹底

改變凝膠比例:分子量大的蛋白用低濃度膠,分子量小的蛋白用高濃度膠。

8、微笑條帶

- 遷移過快

- 電泳溫度過高(改變了 pH 值和遷移速度)

降低遷移速度或低溫電泳(冷庫或冰上)。

9、相同的蛋白雜交出現大小不均勻條帶

- 制備凝膠時凝膠凝固太快,致使泳道中丙烯酰胺的比例不均勻

參照凝膠的配方,在凝膠中加入適量 TEMED,放置時在凝膠頂部加入適量 0.1% SDS(水稀釋)以防凝膠變干。

10、凝膠染色不均勻

- 細菌污染

4°C 保存抗體并使用新鮮的緩沖液浸泡凝膠。

- 抗體量不足

確保在振蕩孵育時抗體充分浸沒膜。

六、常用試劑配置

- 裂解液

這些緩沖液可保存于4°C 幾周,分裝后凍存于-20°C 可以保存一年。

乙基苯基聚乙二醇(NP-40)緩沖液

150mM 氯化鈉

1.0% 乙基苯基聚乙二醇(也可用0.1% 聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100) 代替)

50mM 三羥甲基氨基甲烷-氯化氫(Tris-HCl),pH 8.0

蛋白酶抑制劑

- RIPA緩沖液(放射免疫沉淀測定緩沖液)

150mM 氯化鈉

1.0% 乙基苯基聚乙二醇或0.1% 聚乙二醇辛基苯基醚

0.5% 去氧膽酸鈉

0.1% SDS(十二烷基硫酸鈉)

50mM 三羥甲基氨基甲烷-氯化氫,pH 8.0

蛋白酶抑制劑

注意:RIPA 緩沖液的變性能力要強于乙基苯基聚乙二醇或聚乙二醇辛基苯基醚,因其活性成分包含了離子型去垢劑SDS 和去氧膽酸鈉,在核膜降解和細胞核提取時非常有用。RIPA 緩沖液產生的背景很低,但其也可使蛋白酶變性。

10% 的去氧膽酸鈉儲存液(5 克溶于50ml)必須避光保存。

- 三羥甲基氨基甲烷-氯化氫緩沖液

20mM 三羥甲基氨基甲烷-氯化氫,pH 7.5

蛋白酶抑制劑

- 三羥甲基氨基甲烷-聚乙二醇辛基苯基醚緩沖液(用于細胞骨架蛋白)

10mM 三羥甲基氨基甲烷,pH 7.4

100mM 氯化鈉

1mM 乙二胺四乙酸

1mM 乙二醇雙(2-氨基乙醚)四乙酸

1% 聚乙二醇辛基苯基醚

10% 甘油

0.1% 十二烷基硫酸鈉

0.5% 去氧膽酸鈉

蛋白酶抑制劑

- 非變性裂解緩沖液

20mM 三羥甲基氨基甲烷-氯化氫,pH 8.0

137mM 氯化鈉

10% 甘油

1% 乙基苯基聚乙二醇/聚乙二醇辛基苯基醚

2mM 乙二胺四乙酸

蛋白酶抑制劑

- 無去垢劑型可溶蛋白裂解液

5mM 乙二胺四乙酸

0.02% 疊氮化納

磷酸鹽緩沖液

蛋白酶抑制劑

一些可溶性蛋白不需要使用去垢劑。此緩沖液可用于機械裂解細胞,如用注射器反復抽壓或用Dounce 勻漿機勻漿。

- 變性裂解液/用于不容于去垢劑的抗原的裂解液

1% 十二烷基硫酸鈉

5mM 乙二胺四乙酸

使用前加入:

10mM 的二硫蘇糖醇或β-巰基乙醇

蛋白酶抑制劑

15U/ml DNA I

僅識別變性蛋白的抗體不會與天然型蛋白結合。在收集和裂解細胞時,要將重懸細胞的變性裂解緩沖液加熱。此方法也可用于非離子型去垢劑無法提取的抗原。使用DNA I 有助于從染色質中抽提蛋白。

- 電泳和印?;撼逡?/span>

- Laemmli 2 倍緩沖液/上樣緩沖液

4% 十二烷基硫酸鈉

10% 2-巰基乙醇

20% 甘油

0.004% 溴酚藍

0.125M 三羥甲基氨基甲烷-氯化氫測定pH 值,調整pH 值至6.8

- 電泳緩沖液

25mM 三羥甲基氨基甲烷堿

190mM 甘氨酸

0.1% 十二烷基硫酸鈉

測定pH值,如有必要的話,調整pH 值至8.3

- 轉移緩沖液(濕式)

25mM 三羥甲基氨基甲烷堿

190mM 甘氨酸

20% 甲醇

如有必要的話,pH 值應調節至8.3

大于80 kDa 的蛋白,建議十二烷基硫酸鈉終濃度為0.1%。

- 轉移緩沖液(半干式)

48mM 三羥甲基氨基甲烷

39mM 甘氨酸

20% 甲醇

0.04% 十二烷基硫酸鈉

- 封閉緩沖液

5% 牛奶或BSA(牛血清白蛋白)


加入三乙醇胺-吐溫緩沖液。充分混合后過濾。如不過濾會聚集成斑點,這種小暗點會在顯色時影響印跡的效果。


聲明:以上內容由Abcam公司提供。




序號 最新資訊 瀏覽次數 發布時間
1 WB流程視頻及常用Buffer的配方 268 2017-12-16
2 WB 實驗方案大全 355 2017-12-15
3 免疫沉淀實驗方案大全 250 2017-12-14
4 ELISA 實驗方案大全 139 2017-12-14
5 免疫組化實驗方案 240 2017-12-14