您好,歡迎光臨壯志生物網站!
關注我們
服務熱線:029-82520312

全部產品分類

您當前位置:首頁 >> 資料中心 >>  技術專欄

免疫組化實驗方案

時間:2017-12-14 15:37:05 瀏覽:

免疫組織化學和免疫細胞化學

一、 IHC-石蠟技術指南 (IHC-P)

免疫組織化學 (IHC) 是確定組織切片上蛋白的存在與否及存在位置的一種方法。盡管這種方法在定量分析時靈敏度較免疫印跡法

 ELISA 等 免疫測定方法低,但是它能觀察到整個組織的情況。適用于評估癌癥等疾病的發展及治療情況。因此,從 IHC 獲得的信息結合顯微技術提供 了一副“宏圖”,使來自其它方法的數據有據可依。

 免疫組織化學染色是抗體識別靶抗原的過程。因為抗體是高度特異的,因此它只與組織切片上相應的蛋白結合。應用顯色檢測法即能看到抗 原-抗體反應,一種顯色方法是將與酶結合的抗體作為底物在蛋白位點產生一種色素沉著,另外一種方法是熒光檢測法,即將熒光染料結合到 抗體上,應用熒光顯微技術檢測。

IHC-P 涉及到固定(通常在中性甲醛溶液中固定)組織的染色,然后是在切割之前的石蠟包埋。下面是 IHC-P 技術的基本步驟:

- 組織的固定和包埋

- 切割并封固切片

- 脫蠟復水

- 抗原修復

- 免疫組織化學染色

- 復染(如果需要)

- 脫水并用封固劑封固

- 顯微鏡下觀察染色

1、優化 IHC-P 新抗體

 一種新抗體要應用到 IHC-P 中,就必須找到適宜這種抗體的染色條件。每種抗原都有一個最佳修復方法。每種抗體都有一個最佳稀釋濃度。

抗原修復

試著在沒有抗原修復和應用下列抗原修復方法修復抗原的情況下染色,詳細操作見抗原修復部分(第 30 頁)。

熱修復:枸櫞酸鈉 10 mM,pH 6.0

熱修復:Tris/EDTA pH 9.0

酶解:胰蛋白酶、胃蛋白酶或其它蛋白酶。

抗原修復的最佳方法確定后,就可以進行最佳抗體濃度的確定了。

一抗濃度

如果抗體濃度未知,我們建議用 0.5 μg/ml 和 5 μg/ml 4°C 過夜。如果抗體未經純化,我們建議開始時使用下面的初始稀釋度,也可以嘗試 20 倍的高倍稀釋度。

全抗血清:1/50

腹腔積液:1/100

組織培養上清:不稀釋(也指“neat”)

檢測

我們建議使用辣根過氧化物酶 (HRP),在光學顯微鏡下觀察。過氧化物/DAB 作為底物和色素原。熒光顯微鏡方法中有多種熒光染料標記的 抗體,具體用哪一種要根據試驗需要來進行選擇。

2、固定

正確的固定是免疫組織化學方法的關鍵。最常用的是 10% 中性甲醛溶液 (NBF)。Abcam 說明書推薦 IHC-P 使用該固定劑,除非另有說明。 其它不常用的固定劑如多聚甲醛 (PFA) Bouin's 液(甲醛/苦味酸)等。

理想的固定時間取決于組織塊的大小和類型。對于大多數組織來說,通常固定時間在 18-24 小時之間較為理想。固定不足會導致組織切片因 邊緣染色而信號強,中間未染上而無信號。固定過度將會屏蔽抗原表位??乖薷從兄誑朔簾巫饔?,但是如果固定時間太長(比如一個 星期)那么抗原修復也無濟于事。

固定后,將組織塊包埋于石蠟中,用切片機切成理想厚度(依據組織一般大約在 5-20 微米),然后將切片附著在玻片上,封固最好用正電荷吸 附或 3-氨基-丙酯-三-乙氧基-硅烷 (APES),室溫過夜脫水并徹底干燥。如果切片不能很好的附著在玻片上,可以將其至于 60°C 放置數小時。

3、脫蠟

在開始染色之前,切片必須先脫蠟至水。脫蠟不徹底,就會使切片很難染上色。

材料及試劑

二甲苯

無水乙醇

95% 乙醇

方法

- 將切片置于架子上,依據下列方法沖洗:

- 二甲苯:2 X 3 分鐘

- 二甲苯與無水乙醇 1:1 混勻:3 分鐘

- 無水乙醇:2 X 3 分鐘

- 95% 乙醇:3 分鐘

- 70 %乙醇:3 分鐘

- 50 % 乙醇::3 分鐘

- 冷的自來水小水流沖洗

在開始抗原修復前確保切片一直浸沒在水中以防變干,否則特異抗體不易結合且會有很高的染色背景。

4、抗原修復

大多數甲醛固定的組織在開始染色之前都需要先修復抗原,這是由于在固定過程中產生了亞甲基橋使蛋白之間交聯屏蔽了抗原位點。

兩種抗 原修復方法為熱修復法(稱之為熱誘導抗原表位修復或 HIER)和酶解法。

這些修復方法原理都是將亞甲基橋打斷,使抗原表位暴露出來,以便于抗體結合。有的抗原適合酶解修復,有的抗原適合熱修復。酶解修復 有時會損壞組織的形態結構,因此需要摸索酶濃度和作用時間。Tris/EDTA pH 9.0 的緩沖液適合于大多數抗原,pH 6.0 的枸櫞酸鈉緩沖液也 較為常用。以下網站解釋了為什么 Abcam 建議首選 Tris/EDTA pH 9.0 的緩沖液而不是 pH 6.0 的枸櫞酸鈉緩沖液。 

熱抗原修復需要高壓鍋、微波爐或蒸煮鍋。另外,一些實驗室將玻片置于修復溶液中 60°C 水浴過夜。除非抗原修復方法在抗體數據表中可 以找到,否則必須通過實驗來確定適宜的修復。Abcam建議嘗試多種方法來確定適宜的修復方法,以便于獲得理想的染色。 

熱修復緩沖溶液

下面是三種HIER較為常用的緩沖溶液,對于一個特定的抗體,在沒有其他研究者建議的情況下,要通過實驗確定選用哪種修復緩沖液。

枸櫞酸鈉緩沖液 (10 mM Sodium Citrate, 0.05% 吐溫- 20, pH 6.0)

1 mM EDTA, 調至 pH 8.0

Tris/EDTA 緩沖液 (10mM Tris, 1 mM EDTA 溶液, 0.05% 吐溫-20, pH 9.0)

熱修復法

a) 高壓蒸汽法

玻片要置于金屬架上

材料及試劑

家用不銹鋼高壓鍋

加熱板

玻片架放置容器(容量大約 400-500ml)

抗原修復緩沖液(如 Tris/EDTA pH 9.0,枸櫞酸鈉 pH 6.0)


方法

- 將合適的抗原修復緩沖液加入高壓鍋內,然后將鍋置于加熱板并開至最大功率,此時不要把蓋子蓋緊。在等待煮沸過程中,按前面描述進 行脫蠟至水。

- 煮沸后,將玻片從自來水中取出放入高壓鍋內。小心熱溶液 - 使用鑷子。依照說明書加上加壓閥。

- 高壓鍋達到最大壓力后(見操作手冊),維持 3 分鐘(見注意事項 1)。

- 3 分鐘過后,關掉加熱板,將高壓鍋取下放置。

- 打開高壓鍋閥門(見操作手冊),冷水冷卻鍋身。壓力降下后,打開鍋蓋,冷水冷卻 10 分鐘。

注意事項:

3 分鐘只是抗原修復的建議時間。低于 3 分鐘可能會使修復不徹底,導致染色較弱。而超過 3 分鐘可能會使修復過度,導致非特異性背景 染色,同時增加切片離解的幾率。因此需要做對照試驗,同樣的組織切片分別修復 1、2、3、4、5 分鐘后開始染色,針對所用的特異抗 體選擇最佳修復時間。

確保玻片徹底冷卻可以便于下一步操作,而且使抗原表位在經歷高溫后復原。

 

b) 微波法

不建議使用家用微波爐。因為它會導致抗原修復時冷熱不均。而且由于沒有高壓環境,修復時間較長,會使切片解離。建議使用科研專用微 波爐較為合適。大多品牌的科研專用微波爐都有加壓裝置,能持續保持 98°C 從而避免切片解離。唯一的缺陷就是它的價格昂貴。

使用該方法時,修復緩沖液煮沸會大量蒸發,要確?;撼逡旱牧?,不能使切片變干。

材料和試劑

家用 (850W) 或科研專用微波爐

微波爐專用玻片放置架及容器(容量大約 400-500ml)或染色缸

抗原修復緩沖液(如 Tris/EDTA pH 9.0,枸櫞酸鈉溶液 pH 6.0,等等)

方法

- 按前面描述將切片脫蠟至水。

- 向微波爐專用容器中加入合適的修復緩沖液(見注意事項 1)

- 從自來水中取出切片并放入容器中,置于微波爐內。如果用家用微波爐,就將之開到最大功率至開始沸騰并煮沸 20 分鐘。如果采用科研 專用微波爐,就將溫度設置在 98°C 維持 20 分鐘以修復抗原(見注意事項 2)。

- 20 分鐘后,取出容器放置水中冷卻 10 分鐘。小心熱溶液(見注意事項 3)。

注意事項:

使用非密封的容器,要確保修復緩沖液足以浸沒切片幾厘米,防止在煮沸過程中切片變干。

 20 分鐘只是抗原修復的建議時間。低于 20 分鐘可能會使修復不徹底,導致染色較弱。而超過 20 分鐘可能會使修復過度,導致非特異性 的背景染色,同時會增加組織切片從玻片上解離的幾率。因此需要做對照試驗,同樣的組織切片分別修復5、10、15、20、25、30 分鐘 后開始染色,針對特異抗體選擇最佳修復時間。

確保玻片徹底冷卻可以便于下一部操作,而且使抗原表位在經歷高溫后復原。

c) 蒸煮鍋法

許多實驗室使用蒸煮鍋或電飯煲加熱。此方法與微波法相似,都是將緩沖液溫度維持在 100°C,不同之處在于沸騰時此方法沒有微波法反應 激烈。該方法也可用 100°C 水浴代替。

材料和試劑

蒸煮鍋

玻片放置架及容器(容量大約 400-500ml,如果采用 Tissue –Tek 容器大約 250ml)

抗原修復緩沖液(如 Tris/EDTA pH 9.0,枸櫞酸鈉溶液 pH 6.0,等等)

方法

按前面描述將切片脫蠟至水。

- 依據用戶手冊設置蒸煮鍋并預熱。

- 在燒瓶中加熱適量修復緩沖液并煮沸(用微波爐加熱會更方便)。

- 將盛放玻片架的容器放置蒸煮鍋中。

- 將熱修復緩沖液小心加到容器中,然后放入玻片架。也可以采用更簡捷的操作,先向容器中加熱修復緩沖液再放入蒸煮鍋中。

- 加蓋。盛放緩沖液的容器也須配備蓋子。剛開始時玻片架可能會使修復溶液溫度降低,但幾分鐘內會回升到 95-100°C 之間。

- 達到溫度后維持 20 分鐘。

- 20 分鐘后,取出容器放置水中冷卻 10 分鐘。熱溶液使用注意事項(見微波法注意事項 2)。

d) 酶解抗原修復法

依據抗體數據表中選擇需要的酶。如果沒有,那么胰蛋白酶適用于大多數福爾馬林/PFA 固定后需要修復的抗原。

至少有兩種將酶溶液加到組織上的方法:直接用吸管將酶溶液滴加到玻片的組織上或將組織玻片放入酶溶液中。第一種方法反應試劑需要量 少,但是因為每個玻片需要分別處理,較不容易保證孵育時間的一致。鑒于此,在處理大批量玻片(如數量>5)時,采用第二種方法較容易。 如果采用全自動染色系統(如 Ventana),要查閱酶解修復操作指南。

材料和試劑

? 37°C 孵育箱

? 加濕器(恒溫箱自帶或在容器內放入濕紙巾)

? 兩個盛 TBS 的玻片架容器(TBS 配方詳見緩沖液部分第 71 頁)

? 酶解抗原修復溶液(胰蛋白酶如下所述,胃蛋白酶和蛋白酶K見緩沖液部分第71頁)

 

下面介紹一下胰蛋白酶法。有市售已優化的 IHC 用胰蛋白酶產品(Abcam,貨號 ID ab970).

方法

- 將胰蛋白酶預熱至 37°C。小心的將組織切片周圍的水吸干,然后吸取酶溶液滴加到切片上(一般 50-100μl 即可)。用吸管尖端將酶溶液 鋪蓋住整個切片,注意不要弄壞組織。

- 將玻片置于加濕器內,然后 37°C 孵育。避免直接將玻片放入恒溫箱架子上,否則會因溫度不均影響染色質量。盛放玻片的容器最好先預 熱再放入恒溫箱內。

- 10-20 分鐘(需要優化)后,取出玻片,流水沖洗 3 分鐘。

e) 浸泡法

材料和試劑

37°C 水浴

玻片架及玻片架容器

酶解抗原修復溶液(胰蛋白酶見滴加作用液法,胃蛋白酶和蛋白酶 K 見緩沖液部分第 71 頁)

方法

- 將水浴溫度設置為酶最適宜的溫度。向盛放玻片架的兩個容器中加入超純水。容器放入水浴中加熱。

- 按上述方法將切片脫蠟至水后放入水浴箱其中一個容器中加熱。

- 用水浴箱中另一個容器中的熱水制備酶解抗原修復緩沖液,然后將盛有緩沖液的容器放回水浴箱中重新加熱。

- 將加熱過的玻片放入酶溶液中 10-20 分鐘并間歇緩慢震蕩。取出玻片在流水下沖洗3分鐘,將酶漂洗干凈。

注意事項:

仔細閱讀酶使用手冊,因為有些酶需要特殊的緩沖溶液和活性輔助因子。

水或緩沖液的體積要足夠沒過玻片。

若將冷玻片直接放入酶溶液中會使溶液溫度降低從而酶活性降低,導致抗原位點修復不徹底。

盡可能快的準備出抗原修復緩沖液以避免妨礙酶活性的發揮。放入玻片之前使溶液達到需要的溫度。

10-20 分鐘只是孵育的建議時間。低于 10 分鐘可能會使修復不徹底,導致染色較弱。而超過 20 分鐘可能會使修復過度,導非特異性背 景染色,增加切片從玻片上解離的幾率,損壞組織形態。因此需要先做對照試驗,同樣的組織切片分別孵育 10、15、20、25、30 分鐘后 開始染色,針對特異抗體尋找到最佳修復時間。

5、免疫組織化學染色和檢測實驗方案

 5.1 一般原則

下面的操作適用于沒有全自動染色機或 capillary gap system 等的實驗室(如Shandon Sequenza)??捎夢莧斯ぜ郵約?,該手冊也適用于 全自動或半自動系統。

培養箱應配備有加濕器避免組織變干。變干發生在任何階段最后都會導致非特異性染色及高背景染色。帶密封蓋的淺塑料盒,底部鋪上濕紙 巾就是一個加濕裝置。玻片只要不貼聚紙巾且平放就不會變干,一個好的解決辦法就是,將一根塑料輸液管切割成若干適合恒溫箱的小段, 用膠兩個兩個的粘到恒溫箱底部,每對管之間間隔 4cm,這樣能給玻片一個平穩及升起的小平臺,使玻片直接接觸濕紙巾。

 一抗和二抗的最佳稀釋度可以從數據表中找到,或者通過試驗獲得。根據所獲得的結果調節至最佳稀釋度。要嚴格遵照說明書中的孵育時間。

酶解法中,辣根過氧化物酶 (HRP) 和堿性磷酸酶 (AP) 是最為常用的酶。這些酶有許多底物。

5.2 操作步驟

- 第一天

如使用 HRP 標記二抗檢測,則需要封閉掉內源性過氧化物酶,但我們建議在開始一抗孵育前不予理會。

在含 0.025% Triton X-100 的 TBS 漂洗玻片 2 X 5 分鐘,輕輕震蕩。

用含 10% 正常血清、1% BSA 的 TBS 室溫封閉 2 小時??嶄煞獗找海ú皇瞧矗?,并用紙巾將玻片周圍擦干。

一抗用含 1% BSA 的 TBS 稀釋后加到玻片上。

4°C 孵育過夜。

- 第二天

用含 0.025% Triton X-100 的 TBS 漂洗 2 X 5 分鐘,并輕輕震蕩。

如使用 HRP 標記二抗檢測,則需將玻片在含 0.3% H2O2 的 TBS 中孵育 15 分鐘 以封閉內源性過氧化物酶。

酶法檢測(HRP 或 AP 標記二抗):

參照廠家推薦的稀釋度,用含 1% BSA 的 TBS 稀釋酶標二抗,加到玻片上后室溫孵育 1 小時。

- 熒光檢測:

參照廠家推薦的稀釋度,用含 1% BSA 的 TBS 稀釋熒光標記的二抗,加到玻片上后室溫孵育 1 小時。

 在 TBS 中漂洗 3 X 5 分鐘。

如采用熒光檢測,則結束此步后就可以用封固劑和蓋玻片進行封固了。如采用底物顯色,則還需繼續進行下述操作。

室溫下與底物作用 10 分鐘。

流水沖洗 5 分鐘。

復染(如果需要)。

8脫水,擦干并封固。

5.3 對照

為了評價非特異性交叉反應和 Fc 受體結合的影響,與一抗同型但不相關的抗體(如 BrdU)將來用做對照。與不相關抗原結合的抗體稱為同 型對照。對于全血清抗體而言,對照抗體是來源于同種動物的未免疫正常血清。

如果沒有同型對照,陰性對照也可,就是用抗體稀釋液代替一抗。強力推薦陽性組織對照,確??固宕锏皆て諦Ч?。根據實驗需要,也可設 陰性組織對照,在該組織中應沒有目標蛋白存在的。

注意事項:

- 二抗可能會與組織內的內源性免疫球蛋白發生交叉反應。以二抗同種動物來源的正常血清預處理組織,可減少這種作用。加一抗前先與正 常血清孵育從而消除 Fc 受體與一抗和二抗結合??固逑∈突撼逡褐械?BSA 能降低疏水作用引起的非特異結合。

如果組織樣品經醛類如甲醛、多聚甲醛、戊二醛等固定后用免疫熒光法 (IF) 檢測,在加一抗之前要用含 0.3M 甘氨酸的封閉液封閉。因為甘 氨酸能結合自由醛基,否則這些醛基會與一抗和二抗結合造成高背景染色。使用多聚甲醛或戊二醛固定時,由自由醛基導致的高背景很有 可能發生。

- 一抗應稀釋到廠家推薦的最佳稀釋度或者曾經篩選到的最佳稀釋度。如果沒有起始稀釋倍數,我們建議按下述操作。大多數 IHC-P 用抗體 的使用濃度在 0.5-10μg/ml 之間。要確保一抗和被染色的組織來自不同物種。例如,小鼠組織,一抗來自小鼠,抗鼠 IgG 二抗會與小鼠組 織中的所有內源性 IgG 結合,導致高背景染色。將小鼠單克隆抗體用于小鼠組織將在我們小鼠-對-小鼠部分中討論。

- 過夜孵育可以使低親和力的抗體有較長的時間結合到抗原上。然而,不管抗體親和力的高低,一旦抗原抗體結合達到飽和或平衡,就不會 再發生結合。因此,過夜孵育確保了結合達到平衡。

- 過氧化氫 (H2O2) 能抑制內源性過氧化物酶活性從而降低背景染色。檢測是否存在內源性過氧化物酶,在 DAB (3,3’二氨基鄰苯胺底物)溶液 中水解后孵育組織玻片。如果切片在顯微鏡下出現棕色區域,說明存在過氧化物酶,因此應該做封閉。一些表位被過氧化物修飾了,降低 了抗原抗體的結合。初步孵育后再將切片與過氧化物孵育就能避免此問題。

- TBS 或水稀釋過氧化氫。有些實驗室用甲醇稀釋,甲醇更適合于血涂片或其它富含過氧化物酶的組織如肝臟。甲醇稀釋過氧化氫可減 少水溶液對組織的損壞。對于其它組織,我們建議使用 TBS 或水。甲醇/過氧化物孵育后會降低一些抗原抗體的結合,特別是

- 對于細胞表 面蛋白來說。

- 內源性過氧化物酶的封閉只用于過氧化物酶標記物如 HRP。

- 酶聯底物產生有色沉著。最終產生什么樣的有色沉著取決于用什么酶標簽以及采用水溶性封片劑還是有機溶劑封片劑。

- 觀察組織和細胞形態的復染劑通常是蘇木精(藍色)、核固紅或甲基綠。采用熒光檢測法時,復染用 DAPI(藍色)或碘化吡/ PI(紅色)

- 切記 DAB 是一種致癌物,操作時要穿上防護服。與次氯酸鈉在密封容器中過夜可弱化它的致癌作用(相互作用產生有害氣體),再根據 實驗室操作規程處理。如果使用 AP,取 0.24mg/ml 的左旋四咪唑加到染料溶液中,來抑制內源性磷酸酶的活性從而降低背景染色。

- 如果使用AEC、固紅、INT 或其它水溶性染料,切記它們溶于醇類溶劑中。要選用合適的水溶性封片劑。切勿進行下述步驟中的脫水擦干。

- 通過再水化使切片脫水并擦干其上的 DAB、新品紅、NBT、TVega 紅、NBT 或其它有機染料。按照再水化操作步驟的反向操作。

      - 將玻片置于 50% 乙醇中 3 分鐘。

      - 70% 乙醇 3 分鐘。

      - 95% 乙醇 3 分鐘。

      - 100% 乙醇 3 分鐘。

      - 二甲苯與無水乙醇 1:1 混合液 3 分鐘。

      - 二甲苯 2 X 3 分鐘。

-在適當的有機封固液中封固切片。在有機封固液中封固切片比在水溶性封固液中封固得到的折射率更好。在顯微鏡下看到的圖像更清晰明顯。

5.4 信號放大

親和素—生物素(ABC)

該技術是由 Su-Ming Hsu 及其同事 (J Histochem Cytochem. 1981 Apr 29 (4):577-80) 共同建立的。親和素是在雞蛋白中發現的,親和力高 ,有4個不可逆的生物素結合位點,并且這種結合是不可逆的。生物素是羧基化反應中酶的輔助因子。

簡言之,先將一抗結合到靶蛋白上,再將生物素標記二抗結合到一抗上。另一反應系統中,將親和素與生物素化的酶按一定比例混合形成親和素—生物素—酶復合物,使親和素上保留一定的未結合位點。切片與抗體孵育后再與此復合物共同孵育,使復合物親和素上未結合位點與 生物素化的二抗結合,相比較酶標二抗或一抗而言可以使更多的酶接觸到底物。

親和素—生物素復合物有市售的試劑盒,提供有兩種試劑及結合最佳比例的操作說明。該復合物適用于 Abcam 的任何生物素化的抗體。如果組織中存在有內源性的生物素,如腎臟、肝臟、大腦、前列腺、結腸、腸、睪丸等會與親和素—生物素復合物結合導致背景染色 (Wang and Pevsner, Cell Tissue Res. 1999 Jun;296(3):511-6.)。Abcam提供有抑制這種結合的試劑盒,產品編號是 ab3387。

標記的鏈霉生物素 (LSAB)

該方法同 ABC 法相似,它利用了鏈霉親和素(親和力與卵白素相似)和生物素之間的相互作用。一抗與生物素標記的抗 Ig 二抗結合后,再 與結合在酶或熒光染料上的鏈霉親和素結合。Abcam 提供有鏈霉親和素 — HRP 結合物,產品編號是 ab7403。

應用鏈霉親和素代替生物素可以減少非特異性背景染色,因為鏈霉親和素是非糖基化的,(卵白素不是),因此它不會與凝集素或其它糖結 合蛋白反應。而且 LSAB 法比 ABC 法靈敏 4—8 倍(詳見 Giorno R, Diagno Immunol. 1984;2(3):161-6)。

HRP 聚合物

將二抗與聚合物-酶復合物結合形成的新型聚合物--抗體產物(如抗鼠和/或兔 IgG)優于卵白素生物素 (ABC) 和標記的鏈霉生物素 (LSAB)。 因為此種方法比上述兩種方法減少一步,從而免除了內源性生物素的干擾。Abcam 提供有羊抗兔/鼠 IgG HRP 多聚物,產品編號是 ab2891。

直接酪胺信號放大法 (TSE)

信號擴大最有效的方法之一是 TSE,受專利?;ぃㄓ殖?TSA 或 CSA,不同廠家的試劑盒標示不一樣),特別適用于其它檢測系統難以檢測 到的相對稀少的抗原,并且可以增強結合力弱的抗體的反應結果。

此方法是一抗和 HRP 標記二抗結合后利用過氧化物酶的催化作用,使酪胺蛋白中酪胺部分與抗體共價結合。即使在處理玻片清洗抗體時, 共價結合的蛋白也不會被洗掉,因為酪胺鍵是共價的。將酶或熒光染料標記抗體直接結合到酪胺蛋白結合物的蛋白部分,就可以獲得信號。 市售的試劑盒中蛋白是生物素,應用的是鏈霉親和素標記酶而不是抗體結合物。此方法的缺點是試劑盒昂貴,且步驟多時間長。

二、免疫組織化學 (IHC-Fr)-冷凍切片切割技術

冷凍切片:切片經 3-氨基-丙酯-三-乙氧基-硅烷(APES)包被玻片封固后,最好在 -80°C下保存,需要時再取出。

- 需要時取出后室溫恢復 5 分鐘。

- -20°C 預冷固定劑(丙酮、甲醇或乙醇)30 分鐘。(Abcam 首推丙酮)

- 冷固定劑室溫固定 5-10 分鐘。

- PBS 漂洗 3×4 分鐘。

非醛類固定時不需進行抗原修復步驟。但是如果冷凍組織或細胞經福爾馬林固定,就需要進行抗原修復。但易碎的樣本,如大腦組織或會影 響結果。下面的參考文獻介紹了將切片放置在玻片上之前怎樣用 3-氨基-丙酯-三-乙氧基-硅烷 (APES) 處理玻片。這種處理方法能提高粘附力, 使抗原熱修復對組織形態的損害降到最低:

三、免疫細胞化學 (ICC) 指南

1、一般步驟

- 加蓋玻片,聚氮丙啶或多聚左旋賴氨酸室溫作用 1 小時。

- 滅菌水漂洗蓋玻片 3×5 分鐘。

- 蓋玻片徹底干燥后,紫外燈滅菌至少 4 小時。

- 玻璃蓋玻片上種上細胞,或制作細胞樣本或涂片標本。

- 磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗。

   固定

- 冷甲醇、丙酮固定樣品 1-10 分鐘,或含 3-4% 多聚甲醛 pH 7.4 的 PBS 室溫固定 15 分鐘。

- 冷PBS沖洗樣品2次。

  通透

- 如果靶蛋白是細胞內表達的,那么使細胞膜變通透就很重要了。注:丙酮固定的樣品不需要通透。

- 將樣品在含 0.25% Triton X-100(或 100μM 洋地黃皂苷或 0.5% 皂角苷)的 PBS 中孵育 10 分鐘。Triton X-100 是最常用的去污劑,能增 強抗體的穿透力。因為它對細胞膜有損壞作用,因此不適用于與細胞膜結合的抗原。

- PBS 沖洗細胞 3×5 分鐘。

  封閉及孵育

- 細胞在含1%BSA的PBST(封閉液也可以選擇含1%明膠或10% 與二抗同種動物來源的血清)中孵育30分鐘,以阻斷抗體的非特異性結合。

- 細胞與抗體(含 1% BSA 的 PBST 稀釋)在濕盒中共同孵育,室溫 1 小時,或 4°C 過夜。

- 棄去液體,用 PBS 沖洗細胞 3×5 分鐘。

- 細胞與二抗在 1% BSA 中孵育,室溫 1 小時,避光。

- 棄去二抗溶液,并用 PBS 沖洗細胞 3×5 分鐘,避光。

  復染

- 在 0.1-1μg/ml Hoechst 或 DAPI(DNA 染色劑)中孵育細胞 1 分鐘。

- PBS 沖洗。

  封固

- 向蓋玻片上滴加一滴封固液封固。- 

- 用指甲油密封蓋玻片防止變干并移至顯微鏡下觀察。

- -20°C 或 +4°C 避光保存。

 

四、IHC/ICC 中的固定和通透技術

1、固定:

固定就是保持抗原細胞和亞細胞結構固定不動,同時又能使抗體進入到細胞和亞細胞的所有部位。固定和通透方法的選擇取決于抗原表位和 抗體本身的靈敏性,有時需要優化。

固定時可使用一些交聯試劑,如多聚甲醛,有利于?;は赴峁?,但是可能會降低一些細胞成分的抗原性,因為交聯阻礙了抗體結合。鑒于 此,可采用抗原修復技術,尤其是固定孵育時間較長時或使用高百分比的交聯度固定劑時。另外一種選擇就是使用有機溶劑,但是它們會吸 去脂類使細胞脫水,同時會使蛋白沉淀在細胞架上。

4% 多聚甲醛

- 向玻片滴加 4% 多聚甲醛,維持 10 分鐘。

- PBS 或含 1%BSA 的 PBS 沖洗細胞。

乙醇

向玻片滴加 100-200μl 預冷的 95% 乙醇,5% 冰醋酸,維持 5-10 分鐘。

- PBS 或含 1%BSA 的 PBS 沖洗細胞。

甲醇

- 向玻片滴加 100-200μl 的冷甲醇。 -20°C 維持 10 分鐘。

- PBS 或含 1%BSA 的 PBS 沖洗細胞。

丙酮

- 向玻片滴加 100-200 μl 的冷丙酮。 -20°C 維持 5-10 分鐘。

- PBS 或含 1%BSA 的 PBS 沖洗細胞。

2、通透:

通透技術僅用于抗體需進入細胞內檢測蛋白時,包括細胞內蛋白和抗原表位位于胞內區的跨膜蛋白檢測。

溶劑:

- 丙酮固定也有通透作用。

- 甲醇固定也可通透,但不是總適用。

- 這些反應試劑都可用來固定和通透,也可在交聯劑如多聚甲醛固定后再使用。

去污劑:

- Triton 或 NP-40

  0.1-0.2% Triton 或 NP-40 的 PBS 洗滌 10 分鐘。

 這些去污劑同樣也能溶解部分核膜,因此非常適合于核抗原染色。

- 吐溫-20,皂角苷,洋地黃皂苷和 Leucoperm。

  用0.2-0.5% 洗滌 10-30 分鐘。

  這些是較溫和的細胞膜溶劑。它們會使細胞膜產生足夠大的孔,促使抗體進入細胞內而不用溶解胞膜。適合于胞漿內抗原質膜的胞漿表面抗 原和可溶的核抗原。


特別建議:

- 用丙酮、乙醇或甲醛(高濃度)固定細胞骨架、病毒和一些酶抗原,可獲得理想的結果。

- 位于細胞器和胞漿顆粒上的抗原,其固定和通透方法的選擇取決于抗原本身,需盡量保留表位。

 

五、灌注固定法

出于多種考慮,將小組織片段簡單浸泡在固定液中便能得到合適的固定,對大多數組織來說可能是唯一的固定模式。然而更快、更均一的固 定方法是將固定液通過管道系統如心主動脈或腹部主動脈灌注到組織中。下面介紹一下用 4% 多聚甲醛固定大鼠大多數器官的操作步驟。

1、材料

麻醉劑

手術用剪刀、鑷子、止血鉗

鋸齒小鑷子

手術刀

放置樣品的帶塞子的小瓶 (5-10ml)

0.9% 生理鹽水

500ml 燒杯

4% 多聚甲醛、固定液

手套、防護眼鏡

蠕動泵(或將燒瓶固定在距手術臺上方 150cm 處,口向下)

心主動脈灌注用輸液針,長 50mm,外徑 1.3-1.5mm

帶有靜脈輸血用的滴注腔的灌注裝置

2、心臟灌注固定法

- 設置蠕動泵,安裝灌注裝置和輸液針。首先,取 100ml 水沖洗管道除去管內殘留物,然后燒杯盛滿 4% 冷多聚甲醛(冰盒預冷),將灌注 管末端置入燒杯中。溶液體積應該與動物大小成比例,通常對于一只動物來說 100-200ml 足夠。打開閥門,調節到一個緩慢而穩定的速度 (20ml/min),然后關閉閥門。

- 在操作臺上將剪刀、鑷子和止血鉗放在適宜操作的位置。給動物注射合適劑量的麻醉劑。動物一旦處于麻醉狀態后,將其背部向下放在操 作臺上??梢允褂么庸潭ㄈ繁6鋝歡?。

- 用捏反應法檢測麻醉程度。在開始下述操作之前確保動物是無反應的。

- 在腹部用手術刀沿著膈肌切一個口,用鋒利的剪刀剪開膈肌底部連著的組織,確保能進入胸腔。

- 取大號剪刀,鈍端向下,切穿左胸肋廓。

- 橫向切穿肋骨一到兩厘米,打開胸腔。用止血鉗打開,使心臟暴露出來。準備排血和輸液裝置。

- 用鑷子固定住心臟(心臟應該還在跳動),在左心室跳動部位直接插入針頭,垂直外露 5mm。注意針頭不要插入太多,以防刺破心室壁 影響溶液循環!用止血鉗將針頭固定在輸入口。打開閥門使 0.9% 的生理鹽水以緩慢、穩定的流速大約 20ml/min 輸入動物體內。

- 用剪刀在心房處剪一個口,保證溶液自由流動。如果溶液不能自由流出或溶液從動物的鼻孔或口腔流出,則要讓針頭復位。

- 當血液快排干時,換上 4% 多聚甲醛溶液(200-300ml)。

- 當肝臟自發跳動(福爾馬林“跳舞”)及顏色變淺時表明灌注完成。(注:一般地,一只成年大鼠的灌注時間大約是 30-60 分鐘,但是根據 動物大小和技術的不同也有所差別)。

- 終止灌注,切除靶組織,放置盛有同種固定液的小瓶中,冰上或 4°C 固定 2 小時,再脫水包埋。4°C 浸泡過夜固定,效果更好。

3、腹主動脈灌注法

按上述方法準備材料和動物(步驟 1-3)。

- 在腹部正中橫向剪開一個長切口,打開腹腔,將腸道輕輕推至腹腔左側。

- 小心地將腎主動脈始端下方的主動脈露出。輕輕地將腹主動脈與覆蓋其上的脂肪組織及其它粘聯組織剝離開。

- 用小鑷子將主動脈壁牢牢地固定在距遠端 0.5-1.0cm 分叉處。然后將折針緊貼鑷子插入主動脈腔的近心端。

- 快速連續操作以下步驟:

- 用小剪刀在下腔靜脈剪開一個口。

- 灌注。

- 夾住膈肌下方腎主動脈始端上方的主動脈。

- 腎臟表面呈現顏色均一、變淺發白時表明灌注完成。灌注一只成年大鼠來說流速至少要控制在 60-100ml/min。灌注 3 分鐘。終止灌注,切 除并清理靶組織,并將之放置到盛有同種固定液的小瓶中(見后面的固定步驟),冰上或 4°C 固定 2 小時。4°C 浸泡過夜固定,效果更好。

- 脫水包埋組織。

 

六、鼠對鼠染色注意事項

用鼠抗體對鼠組織染色是個復雜的過程,因為容易導致背景染色高,而且很難消除。 形成這種背景主要是由于組織染色時二抗與內源性的鼠 IgG,或 B 細胞、漿細胞及巨噬細胞上的 Fc 受體結合造成的。

Abcam 不能保證鼠單克隆抗體與鼠組織(除非說明書有顯示)。然而,必需鼠對鼠染色時,應用一些竅門可能會有助于減少這些背景染色。

1、封閉內源性 IgG

- 按常規制備組織切片。

- 在封閉步驟,用血清(與二抗同種動物來源)室溫封閉 30 分鐘。

- PBS-吐溫-20 沖洗 3 X 2 分鐘。

- 組織切片與未結合的抗鼠 IgG 的 AffiniPure Fab 片段(H+L)室溫孵育 1 小時或 4°C 過夜。

- 建議封閉抗體濃度用 0.1 mg/ml,但是否是最佳濃度仍需終端用戶來評估。

- 抗體染色。

2、封閉內源性Fc  受體

以單克隆二抗F(ab)段封閉內源性 Fc 受體,有市售試劑盒。

- 切片在含 1% Triton 的 PBS 中室溫孵育 30 分鐘,“清凈”組織。

- TBS–吐溫-20 作為沖洗緩沖液比 PBS-吐溫-20 更能減少背景染色。

七、 IHC/ICC 疑難解答提示

1、無染色

- 一抗和二抗不匹配  

使用針對一抗的二抗(如一抗來自兔,二抗為抗兔抗體)

- 沒有足夠的一抗與目標蛋白結合

使用低稀釋度抗體。延長 4℃ 孵育時間(如過夜)。

- 抗體的天然結構(3D 形態)受損不適用于 IHC

用天然(非變性的)WB法檢測抗體,確??固迕槐凰鴰?。

- 由于不當儲存、稀釋或反復凍融造成一抗/二抗試劑盒失效

做陽性對照確認一抗/二抗試劑盒的有效性。

- 靶組織中沒有目標蛋白

參照抗體供應商的建議做陽性對照。

- 組織中沒有足夠的目標蛋白

應用信號放大操作。

- 沒有避光保存二抗

避免將二抗處于光照下。

- 脫蠟不徹底

延長脫蠟時間,更換二甲苯。

- 固定步驟(使用福爾馬林和多聚甲醛固定劑)修飾了抗體識別表位

抗原修復法暴露出抗原表位,縮短固定時間。

- 蛋白位于細胞核內(核蛋白),抗體不能穿透核膜

在封閉液和抗體稀釋液中加入通透劑。

- PBS 緩沖液被細菌污染后破壞了靶蛋白的磷酸根

在抗體 PBS 儲存液中加入 0.01% 疊氮化合物,或使用新鮮無菌的 PBS。

 

2、高背景

- 沒有封閉非特異性結合或封閉不充分

延長封閉時間,并考慮改換封閉劑。Abcam 建議用 10% 正常血清封閉切片 1 小時或 1-5% BSA 封閉培養細胞 30 分鐘。

- 一抗濃度過高

滴定法尋找到最佳抗體濃度,或在濃度較低抗體中延長孵育時間(最好是緩慢而準確地結合)。

- 孵育溫度過高

4°C 孵育切片或細胞

- 二抗發生了非特異性結合(被損壞)

不加一抗,做二抗對照。

- 組織沖洗不徹底,有固定劑殘留

所有步驟都要用 PBS 充分洗滌。

- 存在內源性過氧化物酶活性

用酶抑制劑如抑制堿性磷酸酶的鹽酸左旋咪唑 (2mM),或抑制過氧化物酶的 H2O2 (0.3% v/v)。(詳見IHC操作手冊)。

- 固定過度(固定劑用福爾馬林和多聚甲醛)導致抗體識別抗原位點被修飾改變抗原修復方法,縮短與抗原修復液的孵育時間。-- 信號過度放大(信號放大技術)

縮短信號放大孵育時間,稀釋信號擴大試劑盒。

- 底物過量(酶檢測法)

縮短底物孵育時間

- 染料與 PBS 在細胞/組織中相互作用(酶檢測法)

用 Tris 緩沖液沖洗切片后,再與底物孵育。孵育后,Tris緩沖液再次沖洗細胞/切片。

- 通透作用破壞膜并除去了膜蛋白

去除緩沖液中的通透劑


3、非特異性染色

- 一抗/二抗濃度過高

降低抗體濃度和或縮短孵育周期。對比不表達目標蛋白細胞的信號強度。

- 存在內源性過氧化物酶活性

用酶抑制劑如抑制堿性磷酸酶的鹽酸左旋咪唑 (2mM),或抑制過氧化物酶的 H2O2 (0.3% v/v)。(詳見 IHC 操作手冊)。

- 一抗與被染組織同源(如用鼠一抗測鼠組織),加二抗后,二抗會與同源的所有組織結合應用與組織非同源的一抗

- 切片/細胞變干

保持切片/細胞濕度,切勿變干。





聲明:以上內容由Abcam公司提供。

序號 最新資訊 瀏覽次數 發布時間
1 WB流程視頻及常用Buffer的配方 265 2017-12-16
2 WB 實驗方案大全 343 2017-12-15
3 免疫沉淀實驗方案大全 247 2017-12-14
4 ELISA 實驗方案大全 139 2017-12-14
5 免疫組化實驗方案 238 2017-12-14